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醫學拾萃｜6月刊：液體活檢的發祥地和試驗田
本期的文獻導讀是一篇專家綜述《液體活檢的發祥地和試驗田》
September 1, 2018
作者介紹
李小林(Dr. Jerry Li)：北京大學生物化學學士，杜克大學生物化學博士、博士後。多年從事生物技術的研發、推廣、技術以及商務合作。現任美國GIMDX 公司的市場和技術總監，兼任陽普醫療ImproPAS標本處理系統產品線首席科學家。
引言
本期的文獻導讀是一篇專家綜述《液體活檢的發祥地和試驗田》。液體活檢無疑是臨檢的最熱門領域，從它的興起到現在的蓬勃發展和市場化，液體活檢經歷了革命性的變化。我們每一個在醫學臨床檢測的科研工作者，都是這一重大歷史事件的目擊者。液體活檢技術的最初奠定，很大程度上是來源於無創產檢技術。無創產檢提供了一個幾乎完美的技術研發平台，因為這是一個有標準答案的系統，檢測的靶目標是母體血樣系統中胎兒的遊離 DNA，檢測的目的是看這些胎兒的染色體是否異常。這些遊離的胎兒 DNA 的出現有明確的時間表，產量也足夠大。檢測結果是否準確，可以方便地通過與傳統產檢方法比對得出結論。無創產檢作為一個獨立的臨床檢測領域，和腫瘤檢測這個液體活檢的終極目標相比，產檢的技術難度和市場容量都是有限的。這正是試驗田和大田的區別，產檢這個試驗田提供了研發的平台，只有在試驗田裏通過了的概念和方法，才能面對腫瘤檢測這個更為廣闊的領域。
最初人們發現遊離的腫瘤 DNA，到 2010 年後臨床概念的建立和檢測技術的成熟，液體活檢的發展實際上經過了很漫長的過程。液體活檢的發展在很大程度上得益於無創產檢領域的發展。無創產檢（NIPT）由於其在理論和實踐上都和腫瘤的液體活檢很相似，被認為是液體活檢的壹個分支。從無創產檢在 90 年代末建立的那壹刻開始，就成為了液體活檢的發祥地和試驗田。
我們在上一期的《醫學拾萃》中討論了用來研究和鑒定遊離 DNA 身份的兩個重要的模型系統，即凝血系統和創傷系統。這兩個系統都有迅速變化的血液環境，在這樣的環境裏的遊離 DNA 的消長情況不僅提供了遊離 DNA 的生物學指標，更為診斷患者的生理病理情況，比如創傷患者的預後，提供了有力的依據。這兩個系統都是同源系統，即增生的遊離 DNA和本底的遊離 DNA 來自同壹供體。
實際上，從科學發現的角度看，同源系統對於液體活檢的科研來說是有很大難度的，因為同源系統中增生和變化的DNA 是很難追溯的。相比之下，在異源系統中追溯 DNA 要容易得多。最經典的異源系統就是母體和嬰兒，無創產檢就是用母體血樣來鑒定嬰兒基因。在這個系統中，異源的cfDNA 在高分辨率的分子診斷方法學下，可以清晰地判斷出來。
無創產檢後來居上，引領液體活檢
無創產檢領域的
液體活檢的主流市場和終極目標，是通過遊離 DNA 和遊離細胞來完成對腫瘤的檢測。在 1996 年發表在《自然醫學》的兩篇文章裏，美國和瑞士的兩個項目組分別獨立地構建了檢測患者血液中遊離的腫瘤 DNA 的方法 [1,2] 。其中美國約翰霍普金斯大學的 Sidransky 項目組，他們研究了 21 位頭頸癌患者的血清，發現其中 6 位患者有衛星 DNA 的突變，這些突變和實體瘤的癌突變是一致的，而這 6 位患者都發生了癌癥轉移。
幾乎與此同時，瑞士的植物生化和生理實驗室的 Anker 項目組，用肺癌患者的血漿為樣本，發現了在大於 70%的樣本裏可以檢測到載有腫瘤突變的遊離DNA。這兩篇文章為建立當代液體活檢的方法學提供了理論依據。這時，從最初發現遊離的腫瘤 DNA [3] 到建立了初步的方法學，已經過去了 20 年，腫瘤的液體活檢終於有了顯著的進步，但是在展望的同時仍然有很多疑慮 [4,5] 。
無創產檢領域的開創性文獻，是盧煜明於 1997 年在《柳葉刀》上發表的論文，闡述了在母體的血清和血漿中發現了嬰兒 DNA [9] 。在這篇文章裏他研究了 30 位懷有男嬰的孕婦，用PCR 擴增和檢測 DNA，發現其中的 21 位（70%）的血樣裏有Y 染色體的 DNA。因為 Y 染色體是男性特征，只能來源於男嬰，而在非懷孕婦女以及懷有女嬰的對照組樣品裏沒有發現 Y染色體 DNA，所以結論是母體血樣中有遊離的嬰兒 DNA，這為無創產檢提供了理論依據。這篇論文充分發揮了異源 DNA系統的優勢，大繁至簡，用母體環境對照 Y 染色體這個直觀明了的追蹤系統，迅速找到了目標 DNA。文獻，是盧煜明於 1997 年在《柳葉刀》上發表的論文，闡述了在母體的血清和血漿中發現了嬰兒 DNA [9] 。在這篇文章裏他研究了 30 位懷有男嬰的孕婦，用PCR 擴增和檢測 DNA，發現其中的 21 位（70%）的血樣裏有Y 染色體的 DNA。因為 Y 染色體是男性特征，只能來源於男嬰，而在非懷孕婦女以及懷有女嬰的對照組樣品裏沒有發現 Y染色體 DNA，所以結論是母體血樣中有遊離的嬰兒 DNA，這為無創產檢提供了理論依據。這篇論文充分發揮了異源 DNA系統的優勢，大繁至簡，用母體環境對照 Y 染色體這個直觀明了的追蹤系統，迅速找到了目標 DNA。
無創產檢的系統和方法
無創產檢的主要臨床目的，是通過母體血清中遊離的嬰兒DNA 來檢測嬰兒的染色體是否異常 [10-14] 。其中最常見的是對唐氏綜合征的無創檢測 [15-20] 。唐氏綜合征（Down syndrome）又被稱為 21-三體綜合征（trisomy 21），是最常見的嚴重的出生缺陷病，在美國有 35 萬唐氏綜合征的病人，而在全球範圍內唐氏綜合征的發病率和癥狀也都很相似。除了唐氏綜合征，還有其他的染色體異常，包括 13-三體綜合征（trisomy 13，又稱 Patau Syndrome），18-三體綜合征（trisomy 18，又稱Edward Syndrome），特納綜合征（Turner Syndrome，又稱45，X）和較為罕見的全套染色體三體綜合征（Triploidy）。
對於這些染色體遺傳病的無創檢測，已經有了相當多的臨床病例積累 [21-30] 。無創產檢的檢測方法主要是 PCR 和測序，包括大規模平行測序等二代測序方法 [6-8 ， 31-33] 。從現有文獻提供的數據看，無創產檢的系統和傳統方法相比，除了風險的降低，它的檢出率（DR，detection rate）和假陽性率（FPR， false positive rate）也明顯優於傳統方法。至此，無創產檢在安全性、靈敏度、特異性上全方位超越了傳統方法，已經進入了臨床診療指南 [34-35] ，成為主流的檢測方法。基於無創產檢的檢測產品，也陸續在法規上獲得批準。
除了對染色體異常的檢測，無創產檢還提供了更前沿的產檢項目，包括全基因組分析、全轉錄組分析、全基因組甲基化分析、組織來源分析等 [36-39] 。這些前沿的產檢項目雖然還停留在研發階段，沒有進入法規，但也引領了未來的無創產檢，乃至整個液體活檢的方向。
產檢是有標準答案的平台
無創產檢為開發液體活檢的方法和產品提供了一個完美的平台。這個平台最大的優勢，在於能夠提供標準答案。
在無創方法之前，產檢是通過羊水穿刺或絨毛檢查來完成的，用這些傳統方法來檢測染色體異常，是有完整的方法學和大量的臨床案例積累的 [40-46] 。這些傳統方法為無創方法提供了參照和標準答案。產檢的標準答案體現在這個幾個方面：
明確的時間表；
清楚定義的檢測目標；
異源系統。
無論是第一孕期還是第二孕期，染色體異常的出現時機、概率、位點、cfDNA 水平等，都有明確的參考範圍 [47-54] 。所以任何新的產檢方法，包括已經開發的無創檢測，還有未來的產檢方法，只要和現有方法比對，就可以計算出檢出率和假陽性率，相對準確地對新方法的優劣做出鑒別。相對來說，腫瘤的出現或者復發，沒有明確的時間表，突變位點眾多，它是沒有標準答案的，如果要計算出檢出率等參數，其過程也更為復雜，這樣開發新檢測方法的成本和時間要求就更高。並且，產檢提供了明確而簡便的異源系統，每一份嬰兒的 DNA 都有特征 DNA（比如 Y 染色體 DNA），而腫瘤的高度異質性和突變率決定了它作為異源系統，是非常復雜的。可以說，如果沒有無創產檢在近年的技術推動，液體活檢領域到現在還只能是在黑暗中充滿希望地摸索著。
綜合地看，無創產檢作為液體活檢的先行領域，開創了重要的概念和方法學，對液體活檢的整個領域都做出了非常積極的推動作用。從市場規模和未來發展前景看，產檢只是液體活檢的一個很小的部分，但是它作為液體活檢的試驗田，在未來將持續發揮重要作用。
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