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Improve Review : Impact of sample processing on ctDNA and liquid biopsy
醫學拾萃｜4月刊：樣本處理對cfDNA 和液體活檢的影響 by CSO Dr.Jerry Li
April 10, 2019
作者介紹
李小林(Dr. Jerry Li)：北京大學生物化學學士，杜克大學生物化學博士、博士後。多年從事生物技術的研發、推廣、技術以及商務合作。現任美國GIMDX 公司的市場和技術總監，兼任陽普醫療ImproPAS標本處理系統產品線首席科學家。
引言
本期的文獻導讀是一篇專家綜述《樣本處理對cfDNA 和液體活檢的影響》。液體活檢的領域所面臨的首要挑戰，是檢測的靈敏度問題。我們所要追蹤的靶分子是痕量的存在，在一份臨床樣品裏，靶分子時刻都被包裹在百萬倍以上的血液細胞裏, 並隨時可能被血細胞所釋放的百萬倍的基因組核酸所淹沒。這樣看，樣本處理實際上就是液體活檢的第一步，也是非常關鍵的一步。我們全力要保證血液細胞的穩定，保證大量的幹擾核酸不釋放出來，在此基礎上調整溫度、運輸、儲存、純化等條件，來提高遊離DNA 的純化和產出率。樣本保存和處理，對液態活檢的分析結果有著巨大的影響，這是挑戰也是機會，它表明陽普這樣的樣本專家，能夠通過提供高效的產品，來積極推動液體活檢領域的技術進步。
基於cfDNA 的液體活檢是診斷和監測癌癥的重要技術，這已經是目前在醫學診斷行業的共識（3 月刊，《cfDNA 是腫瘤監控的臨床首選技術》）。早在上世紀70 年代，人們就初步發現cfDNA 的診斷學意義，cfDNA 在癌癥患者血液中的水平比正常人高， 而癌癥轉移的患者的cfDNA 又比非轉移患者高[1]。在2000 年後，cfDNA 作為一個可能的診斷技術，引起了普遍關註，盡管人們對前景仍然存疑[2,3]。液體活檢作為一個獨立的概念，是2010 年後逐步成型的，並在幾年內迅速爆發成為診斷醫學行業內部最為熱門的生長點[4-12]。從70 年代到現在，液體活檢的厚積薄發式的發展，得益於兩大領域的進步。第一是分子診斷技術的突破，包括測序、基因組和大數據技術，第二是樣本處理技術的進步。在本期的液體活檢通訊裏，我們將重點討論樣本處理技術，尤其是穩定全血樣本、運輸和貯存、提取和純化DNA 等因素對液體活檢的結果有著怎樣的關聯和影響。
穩定細胞是關鍵
對cfDNA 在分子水平上的準確檢測，取決於我們是否能夠拿到穩定的cfDNA 樣品。導致cfDNA 分子在樣本中丟失的主要原因有兩個，一是細胞破裂導致基因組DNA 的釋放，使得小量的cfDNA 被大量的基因組DNA 掩蓋，另一個原因是細胞破裂導致核酸酶釋放，導致cfDNA 的降解[13-15]。因此穩定cfDNA 的關鍵是穩定血液中的細胞， 主要是穩定白細胞[16-18]，這些白細胞都有細胞核和基因組DNA，因此也是常態下健康人的遊離DNA 的主要來源。相比之下紅細胞因為沒有細胞核和基因組DNA， 紅細胞的破裂不會造成對cfDNA 的掩蓋，但是會造成對DNA 提取操作的視覺上的障礙。
為了穩定cfDNA ， 除了使用穩定劑來穩定細胞和cfDNA，還有一個選項就是盡快操作，把樣本中的血漿（含cfDNA）和血細胞盡快分開，這是現在很多實驗室的做法[19-22]。這個辦法不能從根本上解決問題，因為對於樣本量大、運輸貯存條件欠佳、靶DNA 含量極低等情況，盡快操作是不實際的。所以使用細胞穩定劑來穩定血液細胞，從而保護cfDNA 是根本的解決辦法。檢測cfDNA 的另一個難點，是cfDNA 的分子量很小[23-26]。全血中自然存在的cfDNA 一般的分子量在<200bp，遊離的腫瘤cfDNA 更小，分子量在60-100bp 左右，而從破例的細胞中釋放出的基因組DNA，都在300bp 以上。液體活檢的靶分子，是遊離的腫瘤cfDNA，這些小分子量意味著可檢測的點更少，所以難度也更大。
基於穩定血液細胞的任務，和檢測cfDNA 的難度，用於cfDNA 的細胞穩定劑和特殊采血管的出現就水到渠成了 [18,20,21,27-33]。目前保存cfDNA 的最成熟產品，其中之一是美國的Streck公司生產的BCT 管。這款產品和傳統意義上的採血管有兩點不同，BCT 管內有相當體積的液體穩定劑，而且容積較大（10 毫升）。很多的評估研究都得出結論，如果比較EDTA 管（代表傳統采血管）和BCT（代表新型cfDNA 穩定管），在一周或更長的時間段裏，EDTA 管的血樣造成溶血，這表明血細胞破裂，而檢測結果也證明大量的基因組DNA 被釋放到血漿中，而同樣條件下的BCT 管能夠保持不溶血和基因組DNA 的穩定。根據對采血管的比對研究，人們發現在兩周的時間裏，BCT 管內部的基因組DNA 的量增加了不到2 倍，而EDTA 管內的基因組DNA 量增加了400 倍以上。以BCT 為代表的特殊采血管，已經成為液體活檢的樣本采集、運輸和貯存的首選。
樣本的儲存和運輸
處理液體活檢的血樣，至關重要的一步是選擇合適的貯存和運輸條件[18, 29, 34-39]。對貯存和運輸條件的評估，一般是採用模擬條件，即把采集到指定的採血管中的全血樣本，在指定的溫度和運輸條件上保存。對溫度的研究涵蓋了很廣泛的溫度範圍（-20℃到+40℃），對運輸條件采用搖動樣本來模擬，最終的cfDNA 樣品采用PCR 來檢測靶分子回收率。溫度是貯存和運輸的最重要的參數。高於23℃會造成度會造成全血樣品的溶血和基因組DNA 的釋放。合適的穩度是低溫，但是4℃被視為極端溫度，也會造成細胞破裂和溶血。一般認為低於10℃會造成溶血和基因組DNA 的釋放，因此要避免這個溫度。綜合考慮文獻記錄，對於cfDNA 的保存最適合的穩度是10-23℃。
cfDNA 的純化和產出率
液體活檢的核心檢測技術是高靈敏度、高分辨率的分子生物學技術， 包括使用數字PCR 來檢測指定位點[49-54]，和使用二代測序進行基因組檢測和大量位點的檢測[55-62]。而特殊檢測方法，比如甲基化檢測，對腫瘤來源和演化的研究有重要意義[63-70]。這些技術對於樣本處理方法來說，是下遊的檢測，直接受到來自上遊的樣本處理的影響。而來自樣本處理過程的過度操作，包括使用傳統的福爾馬林或者相關的甲醛、戊二醛來固定細胞的做法，會引起靶DNA 過度片段化並使得PCR 反應的效率明顯降低，最終的檢測結果在基因表達的水平可能造成多達10 倍的誤差[71-75]。
我們知道穩定細胞是保護血液樣本中的cfDNA 的關鍵，而福爾馬林是穩定細胞的終極選擇，可以做到長期保存，但是福爾馬林的作用原理是對蛋白質、核酸的共價交聯，這種化學修飾有些是可逆的，有些是不可逆的[76-78]。對cfDNA 不可逆的化學修飾勢必造成cfDNA 作為讀取和擴增的模板在性質和功能上發生改變，從而對PCR 和測序這些高靈敏度的下遊檢測方法造成負面影響。
建立合理平台評估液體活檢產品
目前常用的cfDNA 穩定劑，比如ImproGene® 管的內含物，被稱為非甲醛類穩定劑，若幹的研究表明這類穩定劑對PCR 的結果沒有顯著影響[79-84]。這些研究都是早期的、初步的研究，而系統的、第三方的評估研究還沒有開展。對於目前百花齊放的cfDNA 穩定劑和cfDNA 保存管市場來說，準確、客觀的評估是保證液體活檢市場有序發展的前提。我們期待根據液體活檢的最前沿的技術和需求，建立一個評估樣本處理方法的平台。這個平台應該和癌癥液體活檢對接，理想情況是用FDA 批準的EGFR 突變測試v2 方法為基礎，進行非小細胞肺癌的樣品檢測[85-95]。
值得一提的是，目前的評估平台多半是以無創產檢為基礎的，無創產檢作為液體活檢的一個分支，最先實現了產業化並引領整個行業的發展[96-101]。但是我們應該認識到無創產檢在技術上的局限，就是無創產檢的靶分子非常豐富，檢測的位點也明確並有限，所以它對於樣本處理過程中的瑕疵，比如基因組DNA 釋放、cfDNA 化學修飾、核酸過度片段化，都有更好的承受能力。換句話說，對於癌癥進行液體活檢的那些高保真、高分辨率的要求，在無創產檢的系統中是可以對付一下的，而滿足了無創產檢的產品，並不一定能滿足癌癥檢測的要求。長期地看，癌癥檢測和監測是液體活檢的主體市場，任何用於液體活檢樣本處理的產品和方法，應該在EGFR-v2 或者類似方法學的評估平台上完成性能評估。