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醫學拾萃 | 12月刊：性激素及甲狀腺功能激素檢測影響因素
綜述《性激素及甲狀腺功能激素檢測影響因素》
December 21, 2018
引言
本期的文獻導讀是一篇綜述《性激素及甲狀腺功能激素檢測影響因素》。性激素和甲狀腺功能激素作為人體中重要的兩大類激素，一直是臨床檢測生殖系統和甲狀腺相關疾病的重要指標。性激素和甲狀腺功能激素的臨床檢測已有較長時間的歷史，期間已建立了基本的檢測值參考區間和檢測流程，檢測方法也隨著技術的發展而產生了更叠，但由於各方面因素的影響，臨床上仍常出現激素的檢測值波動較大的情況。因此，為了保證檢測結果的可靠性和準確性，包括生理、標本采集及處理、檢測方法及幹擾在內的多方面的影響因素一直是臨床檢測者的關註焦點。只有全面準確地識別了檢測影響因素，才能針對其采取合適的控制措施，如建立針對不同人群的檢測值參考區間、建立完善標準的檢測流程、選擇合適的檢測方法等。對性激素和甲狀腺功能激素檢測影響因素識別並采取相應措施不僅可降低檢測誤差使檢測結果更準確可靠，還有助於推動檢測標準的建立和檢測技術的進步，對患者和檢驗人員都有重要意義。我們期待隨著更多研究的開展及技術的進步，將對這些檢測影響因素提出更佳的解決方案，使得性激素及甲狀腺功能激素的檢測值更準確可靠、更有助於相關疾病的診斷。
激素是由內分泌細胞合成並分泌的化學信息物質，對機體的能量代謝、生長發育、器官功能等起重要調節作用，其中性激素和甲狀腺功能激素是對人體有重要作用且臨床上檢測較多的兩大類激素。目前臨床上性激素檢測項目主要有促卵泡生成素（Follicle stimulating hormone，FSH）、促黃體生成素（Luteinizing Hormone，LH）、雌二醇（Estradiol，E2 ） 、 孕 酮 （ Progesterone ， P ） 、 睪 酮 （ Testosterone ，T）、催乳素（Prolactin，PRL）等；甲狀腺功能檢測項目主要有甲狀腺激素（Thyroxine，T4）、三碘甲狀腺原氨酸（ Triiodothyronine ， T3 ） 、 促 甲 狀 腺 激 素 （ Thyroidstimulating hormone ， TSH ） 、 遊 離 甲 狀 腺 激 素 （ Free thyroxine ， FT4 ） 、 遊 離 三 碘 甲 狀 腺 原 氨 酸 （ Free triiodothyronine，FT3）。由於人體內的激素水平含量較低，且其分泌本身以及檢測分析的各個階段都會受到多種因素的影響，進而影響檢測結果和臨床診斷，所以激素檢測的影響因素一直是臨床檢測的關註重點。本文將從生理、標本采集及處理、檢測方法及幹擾三個方面分析性激素及甲狀腺功能激素檢測的影響因素。
1. 生理因素
由於人體機能的復雜多變性，由生理因素引起的激素水平改變是導致激素檢測結果變化的主要因素，一些主要的生理影響因素也是臨床激素檢測建立參考範圍的基礎。
1.1. 年齡及性別
人體在不同年齡往往對應特定的生理階段，而多種激素又有強烈的性別依賴性，因此年齡及性別是激素分泌的重要影響因素。
男性的性激素以 T 為主，血清 T 水平在青春期上升，至20-30 歲達到高峰，此後隨著年齡的增加而逐漸下降[1]。女性的性激素以雌激素、孕激素為主，其水平隨青春期卵巢的發育而逐漸增加，約 30 歲左右達到高峰後逐漸下降，更年期後明顯下降[2]。
血清 TSH 水平隨年齡的增長而升高，908 名研究參與者在 13 年的隨訪時間內平均血清 TSH 由 1.49 mU/L 提高至1.81 mU/L，平均增加 0.32 mU/L，而這種增加在老年人中更明顯[3]。而性別對甲狀腺激素分泌水平的影響有多種研究結果。有研究表明，女性 TSH 較男性高[4,5]，甲狀腺激素的調節作用與性別有關[6]，同時也有研究表明 TSH 和 FT4 與性別無關[7]或僅對 FT3、FT4 有影響而對 TSH 無影響[8]。
1.2 月經周期、妊娠及更年期
隨著年齡及卵巢等不同的生理階段變化，成年女性的性激素、甲狀腺激素水平會在月經周期、妊娠及更年期等特定階段有明顯的變化。
女性月經周期時的性激素水平隨著卵巢周期的變化而變化，E2、FSH、LH 和 P 從月經後 6、7 天開始明顯升高，E2約在 13 天排卵期前達到峰值，P 水平隨著排卵開始繼續升高，在黃體期內達到峰值再逐漸降低直至下一次月經開始[2]。
妊娠時胎盤會持續產生 E2、P 等，但由於平均血漿量增加而可能造成性激素水平相對下降[2]。同時，妊娠時性激素的變化也會引起母體甲狀腺激素水平的改變，並會隨著妊娠期的不同而變化[9]。雌激素會引起母體的甲狀腺激素結合球蛋白水平的上升，進而促進甲狀腺激素的合成與分泌[10]；胚胎細胞大量產生的人絨毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，HCG）有刺激 TSH 受體的作用，進而引起甲狀腺激素增加[11,12]；妊娠時母體對碘的需求量大增，易出現缺碘現象，造成 T3、T4 水平降低，並導致 TSH 反饋性升高[11,12]。
女性更年期階段各性激素變化明顯，開始時 FSH 暫時性升高，絕經期前 5 年血清中的促性腺激素水平顯著增加，絕經後會下降；雌激素在更年期前後 6 個月存在顯著下降的階段，E2 下降最明顯；血清 T、雄烯二醇和性激素結合球蛋白在更年期前後也會顯著下降；絕經 3 ~ 5 年後各激素水平趨於相對穩定狀態[2]。
1.3. 晝夜節律
健康成年男性的 T 分泌呈明顯的晝夜節律，早晨達到峰值，傍晚下降至低谷，老年男性 T 水平較低且晝夜節律較平緩，因此對男性性腺功能衰退的篩查應在早晨取樣[13]。女性正常月經期間，雌激素和孕激素的晝夜分泌重疊，而雄激素的分泌波動較小[14]，E2 節律在月經初潮一年後可能會減弱或消失[15]。
TSH 的分泌也有明顯的晝夜節律，通常在清晨 2:00 ~4:00 達到高峰，下午 5:00 ~ 6:00 達到低谷，波動範圍 5% ~15%，因此，甲狀腺功能的測定也建議在上午採集血樣[12]。
通常來說，採血取樣的時間對多數激素制定參考範圍和解釋其臨床數據都有重要意義，因此應該標準化一天內的取樣時間。
1.4. 季節節律
有研究報道了寒冷季節男性的 T 水平低於炎熱季節[16]，表明 T 水平存在季節性變化，但同時也有研究表明中老年男性的性激素水平不隨季節變化[17]。
人體通過下丘腦-垂體-甲狀腺軸調節體內甲狀腺激素的水平，以適應外部環境溫度的變化，維持自身恒溫狀態[5]。多個研究表明，甲狀腺激素的水平與季節變化相關，夏季的水平要低於冬季[5,6,18]。
1.5. 海拔
研究表明，低海拔地區的居民到高海拔地區後多種激素水平會受影響，如女性 T 水平明顯下降[19]；男性 FSH、PRL下降，T3、T4 增加[20]。但有研究表明海拔對性激素的影響是可逆的，如年輕男性 T、LH、PRL 的降低和 FSH 的增加都會隨著處於高海拔低氧環境的時間延長而逐漸恢復[21]。關於海拔對各激素水平的研究結論各不相同，可能與人種、年齡、居住時間、高原氣候等多種因素的影響有關。
1.6. 生理或心理狀態
人體在健康且平靜狀態時的激素水平會維持相對穩定狀態。緊張、激動、劇烈呼吸、運動等均可導致激素分泌量改變；運動等體液大量丟失的情況可導致激素水平相對升高；睡眠不足會影響性激素分泌水平[22]；另外，心理壓力也會導致激素水平變化，如有研究表明，心理壓力會引起男性血清T 水平降低、LH 和 FSH 水平升高[23]，FT3 水平與抑郁程度呈負相關[24]。
1.7. 飲食
人體內的激素水平可受日常飲食的影響。如：低營養飲食會導致血清總睪酮水平明顯下降[2]；長期攝入過多或過少的碘均會導致甲狀腺功能紊亂[25, 26]。另有研究表明，齋月的長期禁食對女性的性激素水平沒有明顯影響[27]，但男性 T 水平在長期禁食後明顯降低[28]。而目前激素檢測采血前是否需要禁食還缺乏對各個激素的完全驗證，但為了保證檢測的可重復性並且排除攝入營養物質的幹擾，推薦在禁食狀態下采血用於激素檢測[29]。
1.8. 體質指數（BMI）
BMI 可影響人體多種激素的合成和分泌。研究表明，絕經後女性的雌激素、T 和雄烯二酮會隨著 BMI 的增加而增加[30]，而男性的 T 水平與 BMI 呈負相關性[31]；BMI 升高可引起 T3 水平升高，兒童肥胖癥可引起 TSH 和 T3 水平升高，而肥胖患者減肥後各甲狀腺相關激素水平有降低趨勢[32]。
1.9. 藥物
多種藥物會對激素水平產生影響。服用外源性性激素藥物如避孕藥或激素替代治療，可對體內性激素水平直接產生影響；另外其他一些藥物也可影響性激素水平，如研究表明采用芳香酶抑制劑治療絕經後的乳腺癌患者會使 E2 水平下降，停用後上升[33]。而服用左甲狀腺素鈉片可直接明顯提高甲狀腺功能衰退癥患者的 FT3、FT4 水平[34]；治療心律失常的藥物胺碘酮在臨床上偶爾會導致甲亢或甲狀腺功能減退[35]；一些抗精神病藥物，尤其是抗抑郁藥物，會使患者的FT4 水平降低[36]。
1.10. 疾病
與性腺或甲狀腺相關的疾病可直接影響性激素或甲狀腺相關激素的合成和分泌，而一些非性腺或非甲狀腺疾病也可引起激素水平的改變。如研究表明系統性紅斑狼瘡女性的性激素水平與健康女性相比有顯著性差異[37]；原發性腎病綜合征患者的總三碘甲狀腺原氨酸（ Total Triiodothyronine，TT3）、總甲狀腺激素（Total Thyroxine，TT4）水平下降，TSH 水平升高[38]；一些腫瘤疾病也會導致甲狀腺激素水平變化[12]等等。
2. 標本采集及處理因素
2.1. 標本採集
標本的採集質量也是影響激素檢測的重要因素。血液標本的採集應按標準操作規程進行，應避免由於採集操作不規範而造成的標本質量不佳，如採集不當導致溶血可引起 T4濃度降低、止血帶使用時間過長引起血液濃度增加而影響相關檢測等[12]。另外，還應註意需要在被採集者平靜狀態下採集血樣，緊張、興奮、運動後等都會影響激素水平。
用於性激素和甲狀腺激素檢測的血液標本在採集時除需按標準採集程序進行外，還應標準化一天內的取樣時間。根據激素分泌的晝夜節律，推薦在上午 8:00 ~ 11:00 空腹採集血液標本；若需對同一患者多天多次採血監測病情，則應在每天的同一時間段採集。
2.2. 採血管類型
臨床上激素檢測標本類型多為血液，且血液標本常用血清類真空採血管採集，包括無添加劑管、普通促凝管和分離膠促凝管，根據管體材質又分為玻璃和塑料兩種。
不同類型的血清類真空採血管通常對激素的檢測均無顯著影響，但根據不同廠家採血管的具體工藝或質量的不同可能導致不同的檢測結果或影響，如某些分離膠可能吸附或釋放物質而影響檢測，或可能產生膠碎片或油滴，導致堵塞儀器探針、黏附而阻隔電極、在免疫分析系統中幹擾結合等[39]。另外，塑料管的安全性較玻璃管更好，也更適用於自動化檢測設備，且研究表明玻璃和塑料分離膠促凝管在多種激素的檢測上無顯著性差異[40,41]，故推薦使用塑料管採集激素檢測血液樣本。
因此，採血管的選擇也是激素分析前的重要影響因素，實驗室檢測人員可與採血管制造廠家及診斷試劑和檢測儀器廠家共同合作，使採血管對激素檢測的影響最小化。
2.3. 抗凝劑或其他成分
激素檢測通常使用血清樣本，若使用血漿樣本檢測時則需考慮抗凝劑的影響。銪、鋅、鎂等金屬離子是一些免疫試劑中酶（如：堿性磷酸酶 ALP）的輔因子，EDTA、檸檬酸鈉、草酸鹽這類抗凝劑可螯合金屬離子而影響免疫試劑中酶的活性[39]，因此它們不適合用作激素某些免疫檢測的抗凝劑，如研究表明 EDTA•K2 抗凝血漿與血清相比，P、T、E2、ALP 的檢測值均有顯著差異[42]，以血斑法篩查新生兒甲狀腺功能時，EDTA 濃度高於 3.0 g/L 時可引起 TSH 假陽性[43]。但根據檢測方法的不同，若能在過程中排除 EDTA 等抗凝劑幹擾也可采用[42]。另外，有研究表明肝素可與抗體產生非特異性反應幹擾測定而不適用於性激素的檢測[44]。
除抗凝劑外，一些採血管內壁或膠塞上的塗層成分也會影響檢測結果。如研究表明採血管內壁塗層的表面活性劑Silwet L-720 可幹擾免疫檢測，其可使抗體從固相載體上脫離，導致 TT3 檢測值顯著升高[45,46]。
2.4. 標本處理
血液標本從採集後到上機檢測前的前處理過程涉及到多種影響因素，包括：標記、運輸、凝血時間、離心、檢測時間、保存等。標本在採集、處理、分析全過程中均應正確標識、避免信息有誤以及污染，採集後應盡快離心後檢測。標本運輸和處理過程中應避免振動引起溶血而幹擾檢測。由於激素檢測常用血清樣本，所以採血後需待採血管內血液完全凝固後才可離心。若未完全凝固即離心，血清中殘留的纖維蛋白原在檢測過程中可形成纖維蛋白塊，可能導致探針吸樣量不足或被堵塞，同時纖維蛋白也可能幹擾免疫反應而影響結果。
血液標本離心時間和離心力應適宜。離心時間過長及離心力過大易導致溶血，血細胞破裂後釋放胞內物質幹擾檢測；離心時間過短及離心力過小則易導致離心不充分，纖維蛋白或血細胞未與血清完全分離而幹擾檢測。
延遲檢測可使部分激素檢測結果產生顯著差異[47]，因此標本採集後應及時處理並檢測，以防溶血、蛋白沈澱、吸附等影響檢測結果。不能及時送檢的樣本需保存於 4℃，長期保存需分離血清後於-20℃或更低溫凍存，且應避免反復凍融。在-20℃或更低溫長期儲存樣本時，應採用適當方法對檢測結果進行校正以降低誤差[48]。
3. 檢測方法及幹擾因素
3.1.檢測方法
3.1.1. 免疫分析法
目前臨床激素檢測方法以免疫法為主，其中常用的為放射免疫分析法（Radio immunoassay，RIA）和化學發光免疫分析法（Chemiluminescence immunoassay，CLIA）。RIA 是用於激素定量檢測的經典方法，但由於其有放射性汙染的危害而逐漸被淘汰。化學發光免疫分析法（CLIA）將化學發光的高靈敏性與免疫反應的高特異性相結合，並具有線性範圍寬、無放射性危害、操作簡單、分析速度快、易於實現自動化、成本上也易接受等優勢，在臨床診斷、科研等領域都得到了廣泛的應用[49,50]。
但免疫法檢測激素也存在其局限性，如在檢測性腺功能衰退的男女性、兒童或其他低水平性激素濃度的情況時，其可靠性和一致性較差[49-51]。將免疫分析同質譜分析法對比的多項研究表明，當 T 濃度較低時，大部分免疫分析方法對其檢測值存在高估[52-54]。
3.1.2. 質譜分析法
為了彌補免疫分析法在特異性和準確性方面，尤其是低濃度分析物檢測方面的不足，與色譜技術聯用的質譜分析法已經逐漸從實驗室研究技術走向了臨床應用，質譜法具有可單次檢測多個分析物、在廣泛濃度範圍內的準確性高、檢測感興趣化合物的特異性強以及免除了抗體交叉反應帶來的幹擾等優勢[50,55]。
但由於需要專業技術人員操作維護、設備和操作成本較高、缺乏標準化等原因，質譜分析法目前還未得到廣泛的臨床應用，但隨著技術的發展及標準的逐漸建立，質譜法在激素臨床檢測中的應用有望日益增加[50, 55]。
3.2. 免疫法檢測幹擾因素
3.2.1. 患者自身免疫性
患者自身抗體可能與激素靶抗原形成巨大復合物，如PRL 與其 IgG 型抗體結合形成復合物而使檢測難度增加[56]。用競爭法檢測時，甲狀腺激素的自身抗體可與標記示蹤劑和待測激素結合而影響檢測結果[11]。
異嗜性抗體（HA）具有多反應性和低親和力，如類風濕因子（RF），可與捕獲抗體和標記抗體結合，HA 結合與捕獲抗體和標記抗體之間時可導致檢測值偏高，HA 僅與捕獲抗體結合時可導致檢測值偏低[11]，從而幹擾 FSH[57]、PRL[57]、甲狀腺激素[26]等的免疫測定。
與待測激素結構類似或有共同交叉反應表位的內源性物質，均可使激素免疫測定過程中出現交叉反應而影響檢測結果，如 HCG 與 LH、FSH 等高度同源，測定時則可能出現交叉反應[2]。
3.2.2. 交叉反應物
除了患者自身分泌的與激素結構類似或有共同交叉反應表位的內源性物質外，與待檢測激素結構相似的藥物或其他物質也可能因為交叉反應而影響檢測結果[29]，如 5β-二氫 P與 P[58]、甲基 T 與 T[58]。
3.2.3. 溶血、黃疸、脂血
溶血會導致細胞碎片、血紅蛋白等物質的釋放，均會對免疫檢測造成幹擾。其中，血紅蛋白含有血紅素基團，具有類過氧化物酶活性，在以辣根過氧化物酶（ Horseradish Peroxidase，HRP）為標記酶的酶促化學發光測定中，血清樣本中的血紅蛋白濃度較高會幹擾檢測結果。如 500 mg/dL 或1000 mg/dL 的血紅蛋白可導致約 13%或<10%的 E2 濃度檢測值降低，因具體免疫檢測方法的不同而對檢測結果有不同的影響[29]。黃疸標本也常含有內源性過氧化物酶[2]而可幹擾以HRP 為標記酶的酶促化學發光測定。脂血中的脂質可通過對抗體的物理覆蓋阻止抗原抗體結合而幹擾激素檢測，如可導致 P 水平明顯降低[59]。
3.2.4. 鉤狀效應
抗原抗體反應在比例適中時形成的檢測信號才與所測抗原或抗體的水平呈正比，“鉤狀效應”是指免疫反應中抗原抗體比例不合適時，檢測信號反而隨檢測物水平的增加而下降的現象。如 PRL、E2 的水平在正常健康人群血液中較低，而在患病、用藥或懷孕等特殊狀態下會明顯升高而使檢測時易出現鉤狀效應[60]。通常可以通過稀釋標本的方法解決鉤狀效應。
3.2.5. 纖維蛋白
研究表明纖維蛋白的幹擾可引起心肌肌鈣蛋白（cTnI）用免疫法檢測時的假陽性現象[61-63]，以及采用血漿樣本檢測HCG、TSH[64]時也易出現假陽性，可見少量纖維蛋白的存在即可影響免疫檢測的結果。當血液樣本凝固不完全即離心取血清易導致血清樣本中形成纖維蛋白[61,62]，或者抗凝血漿中存在不可溶纖維蛋白[63]，位於樣本表面的纖維蛋白易被前幾個測試吸入，與檢測試劑中的抗原抗體非特異性結合或在分離基質中物理攔截指示酶[61]，從而可能造成“跳值”現象，即非重現性假陽性或初測假陽性，復檢或再次離心後復檢結果往往正常。
因此，為避免激素檢測時纖維蛋白的幹擾，採用血清樣本檢測時應使血液完全凝固後再充分離心分離血清，採用血漿樣本檢測時也應排除不可溶纖維蛋白的存在。若懷疑檢測受到纖維蛋白的幹擾，可將標本再次離心後重新檢測。
3.2.6. 偶然誤差
激素的免疫檢測是高靈敏度的技術，通常會由許多偶然誤差導致異常結果。引起偶然誤差的原因有多種，而很多因素往往被我們忽視。
標本方面引起偶然誤差的原因常有：標本量不足、液面有氣泡、標本受到細菌汙染、樣本間的交叉污染、稀釋樣本未混勻等；檢測儀器方面引起偶爾誤差的原因常有：液路中混入氣泡、加樣針有臟異物、吸液或排液相關閥門故障等維護保養不當情況、檢測試劑失效、試劑混勻時產生氣泡、試劑混勻不充分等。
綜上所述，性激素和甲狀腺功能激素的檢測受到來自生理、標本採集及處理、檢測方法及幹擾三大方面的多種因素影響，需全面考慮才能確保檢測結果準確可靠。對於可控制的影響因素應盡量避免，如採血前與患者溝通使其配合、通過培訓考核標準化標本採集及處理過程、定期保養維護儀器等；對於不可控的影響因素，如患者本身的生理影響因素，可在建立參考範圍及解釋臨床檢測值時考慮其中。通過對激素檢測的影響因素的識別及分析，將有助於降低檢測誤差及建立標準流程，可使臨床檢驗質量控制更全面，檢測結果更準確可靠。
