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我們同時應該看到，血液樣品中的 cfDNA 是處於動態變化的，即便是血漿樣品，它內部的 cfDNA 水平也在穩步提高。同樣是血漿樣品，在常規采血管（比如 EDTA 管）中的 cfDNA 可能比特殊采血管（比如 BCT）中高上百倍 [18] 。所以對於液體活檢的樣品處理，使用細胞穩定劑來穩定血液細胞，是保護 cfDNA 的根本解決辦法 [19-23] 。關於血細胞的穩定和血液樣品貯存運輸，可以參照我們的《4 月刊：樣本處理對cfDNA 和液體活檢的影響》。
Cell Free DNA 參與機體防禦和凝血
Improve Review : Identifying the cell free DNA
醫學拾萃｜5月刊：鑒定遊離 DNA 的身份 by CSO Dr. Jerry Li
September 1, 2018
作者介紹
李小林(Dr. Jerry Li)：北京大學生物化學學士，杜克大學生物化學博士、博士後。多年從事生物技術的研發、推廣、技術以及商務合作。現任美國GIMDX 公司的市場和技術總監，兼任陽普醫療ImproPAS標本處理系統產品線首席科學家。
引言
本期的文獻導讀是一篇專家綜述《鑒定遊離 DNA 的身份》。在現階段液體活檢技術的最重要關註點之一，在於對痕量靶分子的保存和檢測，而這些工作的難度來自於靶分子（比如 cfDNA）以及相應的上百萬倍的幹擾分子都是動態變化的。在正常生理情況、病理情況下，或是離體環境下，cfDNA 的量可能由很少變得更少，但也可能迅速增高，這些動態變化是受到特定的生理活動所驅使的。在本期的綜述裏我們可以看到，在血液凝集系統中，cfDNA 的總量會升高達到 100 倍以上，在創傷系統中 cfDNA 水平也顯著升高，並且和預後直接相關。cfDNA 的這些行為強烈顯示，細胞內外的 cfDNA 不僅是生理活動的終產物和示蹤物，而且也主動參與了細胞功能的調控。這些細胞功能為揭示 cfDNA 的身份提供了很好的工具系統，通過對 cfDNA 的身份的調研，科學家們可以更好地設計檢測機制，來提高液體活檢技術的靈敏度和準確率。
血液中的遊離 DNA（cfDNA）是液體活檢的首要關註點。為了精準檢測這些遊離的 DNA 片段，我們就需要關註 cfDNA 的基本特征，比如濃度、片段大小、序列、穩定性等 [1-4] 。但是更重要的問題，是怎樣鑒定這些 cfDNA 的身份指導行為。比如說我們有了新同事或是新鄰居，好奇的我們首先想要知道新人的身份，從那裏來，以前做過什麽，這樣基本可以預測這人的行為。根據同樣的思路，我們關註 cfDNA 的身份，即它們從那裏來，到那裏去，那些是靶向 DNA，那些是幹擾DNA，那些 DNA 在那些生理環境下有那些生物學行為。這些知識無疑會幫助我們設計更新更好的，來穩定、保護和檢測 cfDNA。
液態活檢的科研領域，我們可以借助目前已經建立了的模型，來總結 cfDNA 的行為特征，從而鑒定其身份。在這裏我們重點討論血液凝集系統和創傷系統，這兩個系統的特點是它們都有非常迅速變化的血液環境。這樣的環境裏，cfDNA 的水平處於顯著的動態變化中，這就為我們提供了非常獨特和寶貴的視角，為我們闡釋了 cfDNA 身份提供了依據。
從血液凝集看遊離 DNA 動態變化
血漿和血清作為最常見的血液樣品，分別是采血系統的抗凝和促凝的產物，它們內含的 cfDNA 的水平有很大差異 [5-12] 。在配對對比試驗中，科研人員對同一患者的血樣在其他條件都對等的條件下，對比分析了血漿樣品和血清樣品，發現血清裏的 cfDNA 的水平是血漿的 14 倍 [5] 到 20 倍 [6] 。這裏指的是新鮮血清和血漿的比對，如果觀察貯存的樣品，人們發現血清內的 cfDNA 水平在穩步上升，在 4℃的環境裏保存 5 天的血清樣本，cfDNA 的水平可以在本底基礎上進一步提高100倍，而同等條件下的血漿裏 cfDNA 的水平基本不變 [6] 。由於血清是血液凝集後的產物，一系列的級聯凝集反應導致血小板富集，化學介質釋放，核酸以及核酸酶釋放，這些都是導致血清中 DNA 水平的變化的可能原因。我們已經知道的是，血清中升高的 DNA 有相當部分是來自白細胞中釋放的 genomic DNA。這些 DNA 不僅量很高，水平和化學性質也很不穩定[13-15] 。更重要的是，對於液體活檢項目中我們關註的靶分子，比如無創產檢中的胎兒 DNA，血清中的量反而比血漿中更少 [16] 。這很可能來自於白細胞釋放的 DNase 對於 cfDNA 的降解作用。
血清不適合做液體活檢的樣品
液體活檢樣品的大忌就是（1）相關 DNA 的量小；（2）無關 DNA 的量大。這兩點在血清中都體現出來了。那麽血清是否不適合做液體活檢的樣品？我們來看看腫瘤監測的情況，因為腫瘤監測相對於產檢、創傷監測這些常規檢查，腫瘤監測的難度更大，是液體活檢的終極挑戰 [17] 。在肺癌患者的血漿對血清的配對對比實驗中，血漿檢測可以看出患者的 cfDNA 的量顯著地高於健康人（24.5ng/mL VS 5.1ng/mL），而血清檢測的結果顯示肺癌患者和健康人的 cfDNA 水平是一樣的。也就是說，在液態活檢的高難度項目中，使用血漿是比血清能更有效地檢出腫瘤的存在。液體活檢的樣品準備對結果有直接影響，血清樣品因為其高水平的 genomic DNA 以及核酸酶，給液體活檢的靶分子檢測提高了難度，因而不適合做液體活檢。
我們同時應該看到，血液樣品中的 cfDNA 是處於動態變化的，即便是血漿樣品，它內部的 cfDNA 水平也在穩步提高。同樣是血漿樣品，在常規采血管（比如 EDTA 管）中的 cfDNA 可能比特殊采血管（比如 BCT）中高上百倍 [18] 。所以對於液體活檢的樣品處理，使用細胞穩定劑來穩定血液細胞，是保護 cfDNA 的根本解決辦法 [19-23] 。關於血細胞的穩定和血液樣品貯存運輸，可以參照我們的《4 月刊：樣本處理對cfDNA 和液體活檢的影響》。
從創傷看 cfDNA 的消長
如果說血清樣品中 cfDNA 變化是局部的、人為促成的，那麽創傷（trauma）過程中 cfDNA 變化則反映了整體的、有機的變化，所以能更加有信服力地說明 cfDNA 的動態和來源。根據對創傷患者的檢測，患者血液中 cfDNA 的水平是無一例外是升高的 [24-35] 。經典的研究發現在創傷發生的20分鐘內，血液中 cfDNA的水平就能夠被檢出有顯著升高 [24] 。如果患者的創傷情況在幾小時內穩定下來，cfDNA 的水平就會穩定並開始下降，反之如果患者情況惡化並最終導致器官衰竭，cfDNA 的水平會持續保持在高點上，最長的可以達到 28 天。根據創傷的種類和嚴重程度，cfDNA 的水平也不同，所以 cfDNA 的水平是創傷預後的一個重要指標。這些觀察涵蓋了多種創傷，包括外科手術、開放性傷口、灼傷、化學燒傷等，這些創傷都看到了 cfDNA 水平的迅速升高。在 2017 年的一份綜述文章裏，人們列舉了 14 個針對創傷 ICU的臨床研究，共計 904 名患者，結論是在創傷病例中，高水平的 cfDNA 和高死亡率是顯著相關的[35] 。
更多的研究發現，對於創傷導致的肺損傷、呼吸壓力癥的患者，相對於最終沒有引發這些並發癥的患者，他們的 cfDNA 的水平要高 12 倍 [25] 。刺穿創傷的患者的 cfDNA 水平高於鈍擊創傷的患者，並發感染的患者的 cfDNA 水平高於比沒有感染的患者 [26] 。在創傷患者的系統裏，不僅核源的 cfDNA 水平升高，線粒體 DNA 的水平也升高 [28] 。這些結果也進一步說明，cfDNA 和機體應急狀態密切相關，和凝血過程密切相關。
Cell Free DNA 參與機體防禦和凝血
細胞的死亡，無論是正常細胞的雕亡，還是癌細胞的死亡，都會造成 cfDNA 的量增 [35-40] 。加上人們對血液凝集過程以及創傷的觀察，很自然地推論出 cfDNA 的來源是細胞死亡造成的。進一步的推論很可能就是，cfDNA 只是死亡細胞的釋放產物，雖然它有重要的示蹤作用，可以幫助鑒別癌細胞、胚胎細胞，但 cfDNA 是被動的、沒有功能的細胞廢物，在血樣中逐漸減少並消失呢，實際情況是否是這樣呢？實際情況總是復雜得多。
根據對血液白細胞和凝血的細致研究，人們發現 cfDNA 是中性粒胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，簡稱NET）的重要組成部分 [41-51] 。中性粒胞外陷阱是近年來新發現的免疫防禦系統，在外來病原體（比如細菌）或是免疫信號的刺激下，中性粒細胞會釋放出特殊的網狀結構來纏在病原體，防止其擴散和增生。這個網狀結構就是中性粒胞外陷阱，是由 cfDNA、組蛋白和抗微生物蛋白組成的 [41] 。沒有 cfDNA就不會形成中性粒胞外陷阱，如果用 DNase 來降解 DNA 會導致中性粒胞外陷阱的失活。這在客觀上解釋了為什麽正常人，無論多麽健康，都是有一定水平的 cfDNA，因為 cfDNA 是機體防禦的一部分。
對中性粒胞外陷阱的研究還發現，這些網結構可以刺激凝血和血栓的形成 [42] 。在動物模型裏，人為提高 cfDNA 的水平，可以直接刺激凝血酶-抗血栓酶復合物的發生和增長，表明 cfDNA 很可能參與了某種凝血刺激信號。在由病原體激活的全血樣品中， cfDNA 的主要來源是中性粒細胞。中性粒胞外陷阱在形成血栓後導致中性粒細胞死亡，同時釋放 cfDNA。這個過程不同於通過細胞雕亡釋放 cfDNA，因為它沒有導致 DNA 長鏈的斷裂 [44] 。
我們知道凝血和血栓過程是機體自我保護的一種機制，但同時它在某些病理情況下也是對機體有傷害作用。無論是保護和傷害，cfDNA 參與凝血和血栓都說明，cfDNA 不只是被動的、沒有功能的細胞成分，而是細胞功能的一部分，是細胞的工具並可以被主動調控。至於 cfDNA 是怎樣被調控的，並用怎樣的機理來調控血凝和血栓，現在人們的知識還很有限。隨著液體活檢領域的科研和臨床研究的展開， cfDNA 在正常生理環境下的身份，一定會更加清晰。