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醫學拾萃 | 2019年7月刊：全血RNA管的應用以及基因表達譜
研究生物樣本中的RNA的活性是非常有挑戰性的，因為RNA的天然本質上就是不穩定、容易降解的物質。
July 29, 2019
引言
本期的文獻導讀是一篇專家綜述《全血RNA管的應用以及基因表達譜》。研究生物樣本中的RNA的活性是非常有挑戰性的，因為信使RNA的天然本質上就是不穩定、容易降解的物質。在提取RNA的操作過程中，溫度、血凝、酶降解等過程也都會加速RNA的降解。提取和檢測RNA活性的過程需要一個整體解決方案，包括樣本收集、提取純化、活性檢測三個部分。樣本收集是最關鍵的一步，需要對RNA分子進行快速、整體的保護。Tempus管和PAXgene管是科研和臨床上最常用的兩類RNA管，針對這兩款產品有很多比對數據，根據兩種RNA保存管對生物樣品庫的血液樣本的保存，並由此制備的基因表達譜來看，兩種系統是有著細微的但是可以重復檢出的差別。RNA樣本在臨床上的最重要的應用，就是通過檢測全血中RNA水平來定量描述不同基因的瞬時表達水平，而對同一樣本的多個基因同時做出檢測並出定量比對就是基因表達譜。
全血RNA管是臨床檢驗領域內的新興專項產品，其功能是負責保存全血樣本裏的各類RNA分子。我們知道信使RNA是基因表達的信號傳遞分子，在研究RNA序列、頻率和對於理解細胞的基因表達以及基因調控，有著重要的指導意義。根據對RNA的轉錄總譜的研究，人們發現細胞內的基因轉錄和表達是非常活躍的，無論正常細胞、突變細胞，無論是人類細胞還是其他物種的細胞，RNA的活性、種類和分布都代表了細胞內部的基因表達的總體狀況[1-3]。因此可以說，RNA分子是研究基因表達的最重要的一扇門，而針對RNA保存和分析的一系列的診斷工具，尤其是全血RNA管，就是開啟RNA這扇門的鑰匙。
一、RNA的意義和挑戰
根據2018年的一份來自歐洲的報道，人類血液中的RNA分子在種類和數量上呈現復雜的多樣性，在研究了100億個RNA分子測序結果後，人們發現除了大家熟知信使RNA（mRNA），RNA片段的總體構成還包括其他多個品種的RNA，包括tRNA、miRNA、piRNA、snoRNA、snRNA和miscRNA[1]。這些都是獨立的RNA片段，而不是其他的RNA的降解物，人們相信這些特種RNA都是特定生理意義的特殊RNA，只是目前它們的功能還不是很清楚。
研究生物樣本中的RNA的活性是非常有挑戰的，因為RNA很容易降解和缺失[4-6]。和DNA的穩定承載遺傳信息的功能不同，RNA作為遺傳信息的短暫輸送介質，其天然本質上就是不穩定、容易降解的物質，信使RNA在基因轉錄和表達完成後會立即降解，這是RNA在細胞內的正常生理現象。在提取RNA的操作過程中，一系列的體外操作，比如溫度、血凝、酶降解等過程，也都對RNA的整體穩定性提出挑戰，加速其降解。在使用RT-PCR、微陣列或NorthernBlot方法來檢測其mRNA的含量時，人們發現mRNA的水平波動很大，在普通EDTA采血管中貯存的血樣中，RNA的降解發生得很快。因此，能夠穩定地保存RNA分子的樣本收集系統，是臨床檢測領域的一個經常性的挑戰和話題。
二、保存RNA的整體方案
提取和檢測RNA活性的過程需要一個整體解決方案，這個方案包括樣本收集、提取純化、活性檢測三個部分[7-10]。這三個部分有機結合，缺一不可。這裏面的樣本收集是最關鍵的一步，需要對RNA分子進行快速、整體的保護。目前使用最普遍的方法，是氯化胍或者硫氰酸胍為主體的離液劑，這是一類活性很強的核酸保護劑和蛋白質變性劑。在高濃度胍巖的條件下，血液細胞可以被在較短時間內消化，核酸和脂類溶解，蛋白質變性沈降，作為蛋白質的RNA降解酶也因此失活，從而做到對各類RNA做出保護.
這種速溶RNA的方法是大多數的全血RNA保存管的技術內核。主要的全血RNA管產品為PAXgene、Tempus和Norgen。PAXgene系列特種采血管，由PreAnalytiX研發推廣，RNA管是PAXgene系列產品的一個。Tempus管由美國的LifeTechnology研發，公司被熱電公司並購後這個產品就隸屬於熱電公司。NorgenRNA管由加拿大的Norgen公司推出。這些產品的共同點，除了管內的大劑量溶劑外，還都有較為系統的RNA提取純化試劑和比較強的技術支持能力。RNA在采血管中的溶解和穩定，與後續在實驗室內的提取純化，是同一個過程的兩個步驟，互相依托。
三、2種主流的RNA管
Tempus管和PAXgene管，是科研和臨床上最常用的兩類RNA管，因此也產生了很多比對數據[12-18]。根據兩種RNA保存管對生物樣品庫的血液樣本的保存，並由此制備的基因表達譜來看，兩種系統是有著細微的但是可以重復檢出的差別。斯坦福的一個課題組針對糖尿病相關的901個基因表達的情況[14]，發現Tempus管所保存的RNA樣本更穩定，制備的RNA表達譜更為準確。在這項研究中，作者比對了Tempus和PAXgene兩個獨立的RNA保存、純化和分析系統，使用1型糖尿病的基因表達圖譜為研究主題，系統地分析了樣本收集、樣本處理的差異可能會導致的結果差異。當對照和患者組的樣品的處理方式不同時，基因表達會發生變化。作者發現使用Tempus系統處理的樣品的基因表達譜比使用PAXgene系統處理的樣品更準確，而樣本處理的變化可能導致基因表達的誤導性變化。挪威的一個課題組發現，Tempus的RNA保存管可以和5種RNA提取方法共用，都能夠提供高質量的RNA產物[13]。
RNA樣本的質量直接受到其純化流程的影響[19-21]。使用微陣列分析2356個基因的表達譜，人們發現即便在不到30分鐘的試驗一停留時間，表達譜也會發生較大的變化。所以即便使用RNA保存管，RNA分子從整體上講還是處於動態的降解過程之中，所以保存和提取RNA的流程必須標準化。
德國一個課題組根據Illumina測序系統產生的上千萬個數據，研究了miRNA樣本質量以及後續的二代測序的影響，RNA管所提供的miRNA對二代測序的結果引發了很大的波動[20]。另一個德國團隊，比較了Tempus采血管和PAXgene采血管，以及相應的RNA提取系統，發現最好的RNA結果，來自於PAXgene管和PAXgene提取系統配合使用[21]。而且他們發現，如果混合配對，即使用一家的RNA采血管和另一家的RNA提取系統，則RNA產物的質量會明顯降低。所以RNA的溶解和純化是同一過程的兩個步驟，不同廠家的產品是不完全匹配的。
四、基因表達譜的臨床應用
RNA樣本在臨床上的最重要的應用，就是通過檢測全血中RNA水平來定量描述不同基因的瞬時表達水平，而對同一樣本的多個基因同時做出檢測並出定量比對就是基因表達譜。基因表達譜是一個很廣闊並迅速發展的科研領域，由於篇幅有限，我們難以在本文裏用足夠的篇幅來介紹基因表達譜。因此我們選取臨床檢測的一個分支領域，即對乳腺癌的基因表達研究和對患者預後，來說明基因表達譜的重要性[22-26]。根據RNA數據建立的21項基因的組合，可以用來預估那些雌激素受體陽性並接收了雌激素受體拮抗劑它莫西芬治療的患者的預後情況[22]。他莫西芬對這類患者的療效較好，很多患者無需化療，但是也總有約15%的患者在5年內復發，因此需要化療來預防復發，而21項基因的基因譜提供了有效的工具，能夠計算復發可能性，從而指導化療並避免過度醫療。根據RNA基礎上的基因譜，還能夠發現新的乳腺癌相關的生物標記物[25]。
除了癌癥預後，基因表達譜還能在用來直接在治療過程中來檢測癌癥治療的療效[26-31]。在黑色素癌的治療過程中，人們比對了服用抗癌藥前和治療後的全血樣本中基因表達譜的變化，對表達量升高的生物標記物做出進一步研究，從而開發出一項有16個生物標記物的組合，這代表了從全血RNA樣本到基因表達譜建立過程[27]。在這個過程中RNA管對RNA分子的全面保護作用，為基因表達譜的準確性和可重復性提供了有力的保障。
